Fronteras en Genética

Introducción

En eucariotas superiores, la información necesaria para la síntesis de proteínas está dispersa por todo el gen, donde los segmentos codificantes (exones) representan una proporción menor. Por lo tanto, el reconocimiento de exones y la eliminación de las secuencias no codificantes (intrones) del pre-ARNm son esenciales para la expresión génica adecuada, y este proceso (empalme) se lleva a cabo por un enorme complejo macromolecular llamado empalme. El primer paso del ensamblaje del spliceosoma implica la unión de la pequeña ribonucleoproteína nuclear U1 (U1snRNP) al sitio de empalme de 5′ (5’ss) por complementariedad con la cola de 5′ de su componente de ARN, U1snRNA (Roca et al., 2005). No es sorprendente que los cambios de nucleótidos que ocurren en el 5’s, al interferir con su reconocimiento y eventualmente conducir a eventos de empalme aberrantes, se asocien comúnmente con fenotipos clínicos graves y se reportan ampliamente (9%) en enfermedades hereditarias humanas (http://www.hgmd.org/). Esta información nos llevó a desarrollar una estrategia de corrección basada en variantes de U1snRNAs diseñadas para restaurar la complementariedad con los 5’ss mutados (U1snRNA compensatorio) (Pinotti et al., 2009). Inesperadamente, también demostramos el potencial de corrección de los ARN-U1 diseñados dirigidos a secuencias intrónicas aguas abajo del exón defectuoso (ARN-U1 específicos del exón; ExSpeU1), que son activos en mutaciones que ocurren en los 5’s, 3’s, así como dentro del exón (Alanis et al., 2012). La eficacia se ha demostrado tanto en varias células (Glaus et al., 2011; Schmid et al., 2011; Balestra et al., 2015; van der Woerd et al., 2015; Dal Mas et al., 2015a; Dal Mas et al., 2015b; Rogalska et al., 2016; Tajnik et al., 2016; Scalet et al., 2017; Scalet et al., 2018; Balestra et al., 2019; Balestra y Branchini, 2019; Scalet et al., 2019) y animales (Balestra et al., 2014; Balestra et al., 2016; Rogalska et al., 2016; Donadon et al., 2018b; Donadon et al., 2019; Lin et al., 2019) modelos de enfermedades humanas.

Sin embargo, la definición de exón es muy compleja y, además de los sitios de empalme, implica una serie de elementos reguladores de empalme, que conducen a la elección de las uniones de empalme correctas y al uso desfavorable de los varios sitios de empalme crípticos (De Conti et al., 2013). Por lo tanto, dependiendo del contexto, los cambios de nucleótidos pueden desencadenar diferentes mecanismos de empalme aberrantes con los que los enfoques de corrección, como el mediado por U1snRNA, deben lidiar.

Aquí, desafiamos los EXSPEU1 en el exón 5 de la F8 como un modelo de contexto en el que los 5’s auténticos están rodeados de varios 5’s crípticos (Figura 1A), un escenario que se complica aún más por la aparición de cambios en los nucleótidos de los 5’s que están asociados con la deficiencia del factor VIII de coagulación (FVIII) (Hemofilia A, HA) (Bolton-Maggs y Pasi, 2003). Los estudios de expresión de minigenos indicaron que estos cambios alteran la delicada interacción entre 5’s, que aparentemente puede ser reequilibrada por un ExSpeU1 dirigido a una secuencia intrónica aguas abajo. Sin embargo, la investigación profunda de las transcripciones rescatadas de las variantes +1 y +2 reveló que el ExSpeU1 reorientó el uso de los crípticos 5’s recién creados, desvaneciendo así el intento de corrección. Estos datos demuestran la aplicabilidad del ExSpeU1 a las mutaciones causantes de HA y refuerzan la importancia del contexto de la secuencia para dictar el resultado del empalme.

Materiales y Métodos

Creación de Vectores de Expresión

Para crear el plásmido pF8wt, la región genómica del gen F8 humano (NC_000023.11) que abarca desde c. 602-464 hasta c. 670+773 se amplificó a partir del ADN genómico de un sujeto normal con cebadores i4F-i5R utilizando UFP ADN polimerasa de alta fidelidad (Transgenómica, Glasgow, Reino Unido). El amplicón F8 se clonó secuencialmente en el vector de expresión pTB (don del profesor F. Pagani, ICGEB, Trieste, Italia) explotando el sitio de restricción NdeI.

Los vectores de expresión pU1F8d, pU1F8s7, pU1F8s16, pU1F8s25 para los U1snRNAs modificados se crearon reemplazando la secuencia entre los sitios de restricción BglII y XbaI con una PCR generada con un cebador delantero específico de U1 (que contiene la cola de 5′ modificada del U1snRNA) y un emparejamiento de base de cebador inverso aguas abajo del sitio de clonación XbaI.

Los vectores de expresión pU7a,b,c,d para los ARN-U7 modificados se crearon como se informó anteriormente (Balestra et al., 2015). En resumen, se ha generado una PCR que contiene el sitio de unión modificado del ARNNU7 diseñado utilizando los cebadores indicados en la Tabla Suplementaria 1 y clonado en el plásmido pSP64 (regalo de Franco Pagani, ICGEB ,A) después de la digestión con sitios de restricción StuI y XbaI.

Todos los vectores se han validado mediante secuenciación.

Las secuencias de oligonucleótidos se proporcionan en la Tabla suplementaria 1.

Expresión en Estudios de Células de Mamíferos y ARNm

Se cultivaron células de Riñón Embrionario Humano 293T (HEK293T) como se describió anteriormente (Farrarese et al., 2018). Las células se sembraron en placas de doce pocillos y se transfectaron con el reactivo Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Quinientos nanogramos de variantes minigénicas de pF8 se transfectaron solas o con un exceso molar (1,5 Veces) de plásmidos pU1/pU7. El ARN total se aisló 24 h después de la transfección con Trizol (Life Technologies), se transcribió inversamente con cebadores aleatorios y se amplificó utilizando la UFP ADN polimerasa (Transgenómica, Glasgow, Reino Unido) con cebadores Alfa y Bra. La misma polimerasa de ADN y los cebadores 4F y 8R se utilizaron para evaluar los patrones de empalme F8 en el hígado humano. El análisis densitométrico para la cuantificación de transcripciones correctas y aberrantes se realizó utilizando el software ImageJ (https://imagej.net).

Para el análisis de electroforesis capilar de desnaturalización, los fragmentos amplificados se etiquetaron utilizando cebadores Alfa y el sujetador con etiqueta fluorescente (colorante FAM) y se ejecutaron en un instrumento ABI-3100 (Waltham, MA, EE.UU.).

Se realizaron tres experimentos independientes para cada variante y condición.

El análisis computacional

La predicción computacional de sitios de empalme y de elementos reguladores de empalme se llevó a cabo utilizando el Buscador de empalme humano (www.umd.be/HSF/) software en línea.

Resultados

El Análisis Computacional Predice Varios 5’ss Competidores

El análisis bioinformático (www.umd.be/HSF3/index.html) predice que el exón 5 de la F8 está bien definido, como lo demuestran las altas puntuaciones de los 5’s y 3’s (94,02 y 94,62, respectivamente) (Figura 1A). Además, predice tres 5’s crípticos en intrón 5, dos de ellos ubicados en las posiciones de nucleótidos +65 y +177 pb, y uno en la proximidad (+5) del auténtico. Todos ellos tienen una puntuación (81, 85 y 96 para +5, +65 y +177 5’s crípticos, respectivamente) cercana a la de los 5’s auténticos y, según la matriz HSF, por encima del umbral de 80.

Esto nos proporcionó un modelo informativo para evaluar la competencia de 5’s y los mecanismos de empalme aberrantes, así como la idoneidad del ExSpeU1 como enfoque de corrección.

Los Cambios en los Nucleótidos del Exón 5 de la F8 Conducen a un empalme Aberrante, Que va Desde el Salto del Exón hasta el Uso de 5 s Intrónicos Crípticos

Para investigar los mecanismos de empalme en el contexto del exón 5 de la F8, creamos un minigeno de la F8 que incluye el exón 5 de la F8 y los intrones circundantes (Figura 1B). La expresión del minigen de tipo salvaje (wt) en células HEK293T indicó que el exón 5 está bien definido, y este patrón recapitula la inclusión completa observada en el ARNm hepático humano (Figura 1C), validando así nuestro enfoque experimental.

Dado que incluso los cambios en los nucleótidos exónicos, como las mutaciones sin sentido, podrían afectar el código de empalme, analizamos la presencia de potenciadores de empalme exónicos (ESEs), que se predijeron mediante análisis computacional. Con este fin, explotamos variantes U7snRNA antisentido diseñadas para apuntar y enmascarar los ESES candidatos (U7a,b,c) o parcialmente los 5’s auténticos (U7d). La coexpresión de estas variantes de U7snRNA con el minigeno de wt reveló que solo el U7d de control afectó el empalme y el salto parcialmente inducido del exón 5 (Figura suplementaria 1). Dado que estos datos no proporcionaron elementos para una selección entre las muchas variaciones de nucleótidos exónicos anotadas en las bases de datos de HA (www.factorviii-db.org / y https://databases.lovd.nl/shared/genes/F8), solo investigamos el cambio de c. 655G > A, siendo el cambio de falta de sentido más frecuente en el exón 5 de F8.

En conjunto, estos datos identificaron mutaciones que causan empalmes aberrantes y proporcionaron candidatos para explorar la corrección de empalmes mediante ExSpeU1s.

Un ExSpeU1 Único Es Capaz de Rescatar Múltiples Mutaciones pero No Variantes en las Posiciones +1 y +2 Debido a un Registro de Empalme Alterado

En el intento de restaurar la definición adecuada del exón, diseñamos un U1snRNA compensatorio y tres ExSpeU1 con complementariedad perfecta con el tipo salvaje 5’ss o las secuencias intrónicas adyacentes, respectivamente (Figura 2A). La eficacia de estas variantes U1snRNA se evaluó inicialmente en la c.El cambio de 669A > T desde que las mutaciones en la posición -2 de los 5’s han demostrado ser rescatables mediante el enfoque modificado basado en U1snRNA (Alanis et al., 2012). Los experimentos de co-transfección nos llevaron a seleccionar el U1sRNA compensatorio (U1d) y un ExSpeU1 (U1sh7) que rescató apreciablemente el empalme. En particular, el análisis densitométrico de bandas reveló que la coexpresión de U1d y U1sh7 se asoció con un aumento de transcripciones correctamente empalmadas (de 52 ± 3% a 71 ± 3% o 75 ± 4% para U1d y U1sh7, respectivamente) (Figura 2A).

Basándose en estos resultados y en el hecho de que el ExSpeU1, al unirse a una región intrónica menos conservada, asegura potencialmente una mayor especificidad de exón (Rogalska et al., 2016; Donadon et al., 2019), el U1sh7 fue seleccionado para una investigación adicional en un panel ampliado de variantes. Los experimentos de transfección mostraron que el U1sh7 rescató notablemente las variantes c. 669A > G, c. 669A > T y c. 670G > T (> 80% de las transcripciones correctas), y también pareció tener un efecto de corrección (de 0% a 4 40%) en las posiciones conservadas +1 (c. 670+1A) y +2 (c. 670+2G) (Figura 2B).

La aparición inesperada de transcripciones con un tamaño compatible con el empalme correcto, incluso para mutantes en las posiciones +1 y +2, nos llevó a analizar más a fondo el resultado del empalme mediante el etiquetado fluorescente de amplicones seguido de electroforesis capilar de desnaturalización (Figura 3 y Figura Suplementaria 3). Este enfoque, en células que expresan las variantes +1 y +2 por sí solas, reveló la presencia de niveles de trazas de transcripciones aberrantes que difieren solo para unos pocos nucleótidos (-1, +1 y +4 pa). En particular, las transcripciones aberrantes de -1 y +1 se identificaron solo en los c. 670 + 1T y c.Contexto 670+2G (7,1 ± 2,4% y 1,3 ± 0,7%, respectivamente), mientras que se detectó el trascripción +4 para el mutante c. 670+1T (1,1 ± 0,8%), c. 670+2G (1,4 ± 0,8%) y c. 669T (1 ± 0,6%).

A través de este enfoque, evaluamos el efecto del U1sh7, que redirigió el spliceosoma en la unión exón-intrón, como lo indican las transcripciones generalmente disminuidas que surgen del uso de los 5’s crípticos distales. Sin embargo, debido a las mutaciones en las posiciones cruciales, el U1sh7 forzó el uso de los 5’s crípticos adyacentes, creados/fortalecidos por mutaciones, y aumentó notablemente la proporción de formas +4 para el c. 670+1T (de 1,1 ± 0,8 a 72,6 ± 2,2%) y c. 670+1A (de 0 a 55,3 ± 2,1%) y formas +1 para el c.670 + 2G (de ∼1% a 3 34%) variantes.

Con respecto a los otros mutantes, la electroforesis capilar desnaturalizante nos permitió completar la evaluación adecuada del rescate mediado por U1sh7 en el panel seleccionado de mutaciones. Como se muestra en la Figura 3B, la co-expresión de la U1sh7 llevado a un apreciable aumento de la proporción de corregir las transcripciones de los c.602-10T > G variante en el 3 ss y la c.669A > T, c.669A > G, c.670G > T, c.670+5G > A, y c de.670+6T variantes en las 5 ss.

Tomados en conjunto, nuestros datos diseccionaron aún más los patrones de empalme aberrantes asociados con las mutaciones causantes de HA e identificaron un ExSpeU1 único capaz de rescatar múltiples mutaciones, a excepción de +1/+2 variantes que sufren de un contexto desfavorable.

Discusión

El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha ampliado enormemente el número de variaciones genéticas asociadas con enfermedades humanas, planteando así el problema de identificar las causantes. Esto es particularmente difícil para los cambios de nucleótidos que, estando en los límites exón-intrón o dentro de los intrones, son candidatos a afectar el empalme, ya que su efecto preciso es difícilmente predecible por las herramientas computacionales. El escenario se complica aún más por el empalme superpuesto y los códigos de aminoácidos dentro de los exones, lo que podría conducir a cambios de sentido erróneo que ejercen sus funciones patógenas al alterar el proceso de empalme en lugar de la biología de las proteínas (Tajnik et al., 2016; Donadon et al., 2018a).

En este contexto, la evaluación experimental del impacto de los cambios de nucleótidos en el empalme es obligatoria para ayudar en el diagnóstico y el asesoramiento. Aquí, abordamos este tema en un contexto génico singular, a saber, el exón 5 de la F8, donde varios cambios exónicos y múltiples 5’s crípticos se encuentran respectivamente dentro o cerca de los 5’s auténticos, lo que complica la selección del correcto.

El análisis del patrón de empalme de la c.El cambio de nucleótidos de 602-10A > G, con niveles apreciables (∼38%) de transcripciones correctamente empalmadas, es consistente con el fenotipo de coagulación leve reportado en el paciente. Por el contrario, la c.602G > A (p.G201E), c.655G > A (p.A219T), y c de.667G > A (p.E223G) variantes sin sentido no se asocia con una significativa empalme alteraciones, lo que indica que la deficiencia de FVIII es causada principalmente por el subyacente sustituciones de aminoácidos menoscabo de la biosíntesis de proteínas/función. Esta observación también se ve reforzada por los datos con U7snRNAs antisentidos que no apoyan la presencia de elementos exónicos reguladores importantes en el exón 5 de la F8, que podrían haber sido alterados por cambios exónicos. Sin embargo, en la proximidad de los 5’s, el código de empalme se solapa con el registro de aminoácidos, siendo el de empalme el primero utilizado en el flujo de expresión génica. Sobre las mutaciones que ocurren dentro de las 5 ss, vale la pena señalar que el exonic c.669A > G (p.E223E), c.669A > T (p.E223D), y c de.670G > T (p.G224W) variantes claramente alterar el empalme. Mientras que la c.669A > T se asocia principalmente con el salto de exones y la pérdida de definición de exones, las variantes c. 669A > G y particularmente las variantes c. 670G > T conducen a una retención intrónica parcial, con el uso de un fuerte intrón 5’s en la posición +177. Notablemente, el análisis de empalme de variantes en diferentes posiciones del mismo triplete (c. 667G > A, c. 669A > G, y c. 669A > T) que codifican el ácido glutámico en la posición 233 en el FVIII dio lugar a diferentes resultados de empalme, que van desde el salto de exones hasta el uso de empalme críptico 5’ss o nulo. Este hallazgo destaca la necesidad de una evaluación cuidadosa de los efectos de los cambios exónicos en el empalme, debido a la ayuda limitada del análisis bioinformático para predecir la patogenicidad de los cambios en los nucleótidos. Vale la pena señalar que los niveles de transcripciones correctas para las variantes c. 669A > T (p. E223D) (∼40%) y c. 670G > T (∼10%) sugieren que la deficiencia asociada de FVIII (moderada/grave) surgiría de una combinación de empalme y deterioro de proteínas. Por otro lado, las mutaciones en las posiciones intrónicas +1/+2/+5 no eran compatibles con el empalme correcto. De manera diferente, la variante +6 condujo a niveles notables de transcripciones correctamente empalmadas, de acuerdo con los fenotipos de coagulación graves o leves reportados en pacientes con AH, respectivamente.

El conocimiento de patrones de empalme aberrantes sienta las bases para la exploración de enfoques de corrección con fines terapéuticos, como hicimos en varios otros modelos de enfermedades humanas. La intervención a nivel de ARNm tiene la ventaja de mantener la regulación fisiológica de los genes y se basa en la entrega de pequeños casetes codificadores, lo que permite la explotación de cualquier estrategia de vectores virales. Entre las diferentes estrategias, los ARN U1 diseñados demostraron la capacidad de rescatar múltiples tipos de mutaciones, incluidos los cambios en 5’s, 3’s, así como dentro de los exones, en modelos celulares y animales de enfermedad humana (Glaus et al., 2011; Schmid et al., 2011; Balestra et al., 2014; Balestra et al., 2015; van der Woerd et al., 2015; Dal Mas et al., 2015a; Dal Mas et al., 2015b; Balestra et al., 2016; Rogalska et al., 2016; Tajnik et al., 2016; Scalet et al., 2017; Scalet et al., 2018; Donadon et al., 2018b; Donadon et al., 2019; Scalet et al., 2019). Notablemente, se demostró que los ARN-U1 modificados preservan su efecto de corrección incluso cuando se dirigen a regiones intrónicas aguas abajo del exón defectuoso (ExSpeU1) a través de un mecanismo que, a diferencia de los oligonucleótidos antisentidos que bloquean un elemento intrónico, involucra el ensamblaje de U1snRNP, la activación de empalmes y el reclutamiento de factores de empalme (Martínez-Pizarro et al., 2018; Rogalska et al., 2016). Además, esta segunda generación de ARN-U1 modificados asegura potencialmente una mayor especificidad de exones y genes, ya que su capacidad de emparejamiento de bases con secuencias intrónicas y, por lo tanto, menos conservadas, como lo confirman estudios recientes (Donadon et al., 2019; Rogalska et al., 2016). No obstante, el efecto fuera del objetivo de cada ExEspE1 debe evaluarse cuidadosamente al acercarse a las clínicas.

En el contexto del exón 5 de la F8, identificamos un ExSpeU1 capaz de restaurar la definición adecuada del exón en presencia de múltiples mutaciones, localizadas tanto en 3’s como en 5’s. Curiosamente, observamos que las variantes en la posición + 1 y + 2 de 5’s, que no se cree que sean rescatables por U1snRNA modificado debido a su alto grado de conservación, dieron lugar a transcripciones con un tamaño comparable al de los empalmados correctamente. Recientemente, se ha demostrado que la transición T > C en la posición +2 de 5’ss es rescatable mediante un ARNR U1 modificado (Scalet et al., 2019), un hallazgo compatible con la observación de que una pequeña fracción de intrones eliminados por el spliceosoma de tipo U2 tiene citidina en la posición +2 (Burset et al., 2000). También hay ejemplos de mutaciones en la posición + 1 que son compatibles con el procesamiento correcto (Hartmann et al., 2010), que potencialmente abren la posibilidad de rescatarlos. Aquí, para diseccionar la naturaleza esquiva de las transcripciones, explotamos la electroforesis capilar desnaturalizante, una estrategia capaz de distinguir amplicones que difieren por un solo nucleótido. El análisis de los patrones de empalme reveló el uso de 5’s crípticos creados por mutaciones (c. 670 + 1G > T y c. 670 + 2T > G) que conducen a transcripciones respectivamente más cortas o más largas de un solo nucleótido. Desafortunadamente, debido al registro alterado de los 5’s, el ExSpeU1 promovió aún más el uso de los 5’s distintos del auténtico, desvaneciendo así el efecto de corrección.

En conclusión, a través de la caracterización molecular de varias variantes del exón 5 de F8 que ocurren en el 3’ss o 5’ss, o dentro del exón, demostramos por primera vez la capacidad de un ExSpeU1 único para rescatar múltiples mutaciones F8 causantes de HA. Además, nuestros hallazgos destacan la necesidad de investigar el efecto en el empalme de los cambios de nucleótidos, particularmente de los que ocurren en secuencias exónicas, y sugieren una inspección cuidadosa del contexto de la secuencia y la evaluación de las transcripciones para evitar interpretaciones excesivas, con implicaciones para el diagnóstico y el asesoramiento.

Declaración de Disponibilidad de Datos

Todos los conjuntos de datos generados para este estudio están incluidos en el manuscrito/Archivos Complementarios.

Declaración de ética

La aprobación de ética para este estudio no fue requerida según la legislación local. No obstante, la muestra de ADN del paciente control fue utilizada después de obtener el consentimiento informado.

Contribuciones de los autores

Todos los autores contribuyeron significativamente al manuscrito. El manuscrito fue concebido y preparado por DB, MP y FB. IM realizó el análisis de electroforesis capilar y AB, MF y DB realizaron los experimentos. En general, la claridad del manuscrito fue revisada por todos los autores y todos aprobaron su contenido.

Financiación

Los autores desean reconocer el apoyo prestado por el Programa de Premios Bayer para la Hemofilia en los Primeros Años de Carrera (BHAP 2017, DB).

Conflicto de intereses

MP es inventor de una patente (PCT/IB2011/054573) sobre U1snRNAs modificados.

Los demás autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Material suplementario