Frontiers in Genetics

Introduction

Chez les eucaryotes supérieurs, les informations nécessaires à la synthèse des protéines sont dispersées à travers le gène, où les segments codants (exons) représentent une proportion mineure. Par conséquent, la reconnaissance des exons et l’élimination des séquences non codantes (introns) du pré-ARNm sont essentielles à une expression génique correcte, et ce processus (épissage) est effectué par un énorme complexe macromoléculaire nommé spliceosome. La première étape de l’assemblage du splicéosome consiste à lier la petite ribonucléoprotéine nucléaire U1 (U1snRNP) au site d’épissure en 5′ (5’ss) par complémentarité avec la queue en 5′ de son composant ARN, U1snRNA (Roca et al., 2005). Sans surprise, les modifications nucléotidiques survenant au niveau des 5’s, en interférant avec sa reconnaissance et en conduisant éventuellement à des événements d’épissage aberrants, sont généralement associées à des phénotypes cliniques sévères et sont largement (9%) rapportées dans les maladies héréditaires humaines (http://www.hgmd.org/). Ces informations nous ont amenés à développer une stratégie de correction basée sur des variantes U1snRNAs destinées à rétablir la complémentarité avec les 5’s mutés (ARNU U1SNR compensatoire) (Pinotti et al., 2009). De façon inattendue, nous avons également démontré le potentiel de correction des U1SNRNA modifiés ciblant les séquences introniques en aval de l’exon défectueux (U1SNRNA spécifiques à l’exon ; ExSpeU1), qui sont actives sur les mutations survenant au niveau des 5’ss, 3’ss ainsi qu’au sein de l’exon (Alanis et al., 2012). L’efficacité a été prouvée à la fois dans plusieurs cellules (Glaus et al., 2011; Schmid et coll., 2011; Balestra et coll., 2015; van der Woerd et coll., 2015; Dal Mas et coll., 2015a; Dal Mas et coll., 2015b; Rogalska et coll., 2016; Tajnik et coll., 2016; Scalet et coll., 2017; Scalet et coll., 2018; Balestra et coll., 2019; Balestra et Branchini, 2019; Scalet et al., 2019) et des animaux (Balestra et al., 2014; Balestra et coll., 2016; Rogalska et coll., 2016; Donadon et coll., 2018b; Donadon et coll., 2019; Lin et coll., 2019) modèles de maladies humaines.

Cependant, la définition de l’exon est très complexe et, outre les sites d’épissure, implique une série d’éléments régulateurs d’épissure, qui conduisent au choix des jonctions d’épissure correctes et à l’utilisation défavorable des plusieurs sites d’épissure cryptiques (De Conti et al., 2013). Par conséquent, selon le contexte, les changements nucléotidiques peuvent déclencher différents mécanismes d’épissage aberrants auxquels les approches de correction, telles que celle médiée par l’ARNU U1SNR, doivent faire face.

Ici, nous avons contesté les EXSPEU1 de l’exon 5 F8 en tant que modèle de contexte dans lequel les 5’s authentiques sont entourés de divers 5’s cryptiques (Figure 1A), un scénario encore compliqué par l’apparition de changements nucléotidiques au niveau des 5’s associés à un déficit en facteur VIII de coagulation (FVIII) (Hémophilie A, HA) (Bolton-Maggs et Pasi, 2003). Les études d’expression des minigènes ont indiqué que ces changements altèrent l’interaction délicate entre les 5’s, qui peut apparemment être rééquilibrée par un ExSpeU1 ciblant une séquence intronique en aval. Cependant, l’étude approfondie des transcriptions sauvées des variantes +1 et +2 a révélé que l’ExSpeU1 a réorienté l’utilisation des 5’s cryptiques nouvellement créés, faisant ainsi disparaître la tentative de correction. Ces données démontrent l’applicabilité de l’ExSpeU1 aux mutations à l’origine de l’HA et renforcent l’importance du contexte de séquence pour dicter le résultat de l’épissage.

Matériaux et méthodes

Création de Vecteurs d’expression

Pour créer le plasmide pF8wt, la région génomique du gène F8 humain (NC_000023.11) s’étendant de c. 602-464 à c.670 + 773 a été amplifiée à partir de l’ADN génomique d’un sujet normal avec des amorces i4F-i5R utilisant de l’ADN-polymérase Pfu haute fidélité (Transgénomique, Glasgow, Royaume-Uni). L’amplicon F8 a été cloné séquentiellement dans le vecteur d’expression pTB (don du professeur F. Pagani, ICGEB, Trieste, Italie) en exploitant le site de restriction NdeI.

Les vecteurs d’expression pU1F8d, pU1F8s7, pU1F8s16, pU1F8s25 des ARNR U1SNR modifiés ont été créés en remplaçant la séquence entre les sites de restriction BglII et XbaI par une PCR générée avec une amorce directe spécifique à U1 (contenant la queue 5′ modifiée de l’ARNr U1SNR) et un appariement de base d’amorce inverse en aval du site de clonage XbaI.

Les vecteurs d’expression pU7a, b, c, d pour les U7SNRNA modifiés ont été créés comme indiqué précédemment (Balestra et al., 2015). Brièvement, une PCR contenant le site de liaison modifié de l’ARN U7SNR modifié a été générée en utilisant les amorces indiquées dans le tableau supplémentaire 1 et clonée dans le plasmide pSP64 (don de Franco Pagani, ICGEB, ITA) après digestion avec des sites de restriction StuI et XbaI.

Tous les vecteurs ont été validés par séquençage.Des séquences

d’oligonucléotides sont fournies dans le Tableau complémentaire 1.

Expression dans des cellules de mammifères et Études sur l’ARNm

Des cellules rénales embrioniques humaines 293T (HEK293T) ont été cultivées comme décrit précédemment (Farrarese et al., 2018). Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à douze puits et transfectées avec le réactif Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), selon le protocole du fabricant.

Cinq cents nanogrammes de variants minigènes pF8 ont été transfectés seuls ou avec un excès molaire (1,5X) des plasmides pU1/pU7. L’ARN total a été isolé 24 h après la transfection avec Trizol (Life Technologies), transcrit en inverse avec des amorces aléatoires et amplifié à l’aide de l’ADN-polymérase Pfu (Transgénomique, Glasgow, Royaume-Uni) avec des amorces Alfa et Bra. La même ADN polymérase et les amorces 4F et 8R ont été utilisées pour évaluer les schémas d’épissage F8 dans le foie humain. L’analyse densitométrique pour la quantification des transcriptions correctes et aberrantes a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.net).

Pour l’analyse par électrophorèse capillaire dénaturée, les fragments amplifiés ont été marqués à l’aide d’amorces Alfa et du Bra (colorant FAM) marqué par fluorescence et exécutés sur un instrument ABI-3100 (Waltham, MA, USA).

Trois expériences indépendantes ont été menées pour chaque variante et condition.

Analyse computationnelle

La prédiction computationnelle des sites d’épissure et des éléments régulateurs d’épissage a été réalisée à l’aide du Détecteur d’épissage humain (www.umd.be/HSF /) logiciel en ligne.

Résultats

L’Analyse Computationnelle Prédit Plusieurs 5’s Concurrentes

L’analyse bioinformatique (www.umd.be/HSF3/index.html ) prédit que l’exon 5 F8 est bien défini, comme le démontrent les scores élevés des 5’ss et 3’ss (94,02 et 94,62, respectivement) (Figure 1A). De plus, il prédit trois 5’s cryptiques dans l’intron 5, deux d’entre eux situés aux positions nucléotidiques +65 et +177 pb, et un à proximité (+5) de l’authentique. Tous ont un score (81, 85 et 96 pour +5, +65 et +177 5’s cryptiques, respectivement) proche de celui des 5’s authentiques et, sur la base de la matrice HSF, supérieur au seuil de 80.

Cela nous a fourni un modèle informatif pour évaluer la concurrence 5’s et les mécanismes d’épissage aberrants ainsi que la pertinence de l’ExSpeU1 comme approche de correction.

Les changements de nucléotides de l’Exon 5 F8 Conduisent à un épissage Aberrant, Allant du Saut d’Exon à l’Utilisation de 5’s Introniques Cryptiques

Pour étudier les mécanismes d’épissage dans le contexte de l’exon 5 F8, nous avons créé un minigène F8 comprenant l’exon 5 F8 et les introns environnants (Figure 1B). L’expression du minigène de type sauvage (wt) dans les cellules HEK293T a indiqué que l’exon 5 est bien défini, et ce schéma résume l’inclusion complète observée dans l’ARNm du foie humain (Figure 1C), validant ainsi notre approche expérimentale.

Étant donné que même des changements de nucléotides exoniques tels que des mutations faux sens peuvent affecter le code d’épissage, nous avons examiné la présence d’améliorateurs d’épissage exoniques (ESE), qui ont été prédits par analyse computationnelle. Pour ce faire, nous avons exploité des variantes antisens de l’ARNU U7SNN conçues pour cibler et masquer les ESEs candidates (U7a, b, c) ou partiellement les 5’s authentiques (U7d). La co-expression de ces variantes de l’ARNU U7SNR avec le minigène wt a révélé que seul le témoin U7d affectait l’épissage et induisait partiellement le saut de l’exon 5 (Figure supplémentaire 1). Étant donné que ces données n’ont pas fourni d’éléments pour une sélection parmi les nombreuses variations de nucléotides exoniques annotées dans les bases de données HA (www.factorviii-db.org / et https://databases.lovd.nl/shared/genes/F8), nous n’avons étudié que le changement c.655G > A, étant le changement de faux sens le plus fréquent dans l’exon 5 F8.

Prises ensemble, ces données ont identifié des mutations provoquant un épissage aberrant et ont fourni des candidats pour explorer la correction d’épissage par EXSPEU1.

Un ExSpeU1 Unique Est Capable de Sauver de Multiples Mutations mais Pas de Variantes aux Positions +1 et +2 En raison d’un Registre d’épissage Modifié

Dans le but de restaurer une définition correcte de l’exon, nous avons conçu un ARNR U1SNN compensatoire et trois ExSpeU1 avec une complémentarité parfaite avec les 5’s de type sauvage ou les séquences introniques adjacentes, respectivement (Figure 2A). L’efficacité de ces variantes de l’ARNU U1SNR a été initialement évaluée sur le c.Changement de 669A > T puisque des mutations en position -2 des 5’s ont été précédemment démontrées comme pouvant être sauvées par l’approche basée sur l’ARNRU U1SN modifié (Alanis et al., 2012). Des expériences de co-transfection nous ont conduit à sélectionner l’ARNU U1S compensatoire (U1d) et un ExSpeU1 (U1sh7) qui ont permis de sauver sensiblement l’épissage. En particulier, l’analyse densitométrique des bandes a révélé que la co-expression des U1d et U1sh7 était associée à une augmentation des transcrits correctement épissés (de 52 ± 3% à 71 ± 3% ou 75 ± 4 % pour U1d et U1sh7, respectivement) (Figure 2A).

Sur la base de ces résultats et du fait que l’ExSpeU1, en se liant à une région intronique moins conservée, assure potentiellement une spécificité d’exon plus élevée (Rogalska et al., 2016; Donadon et coll., 2019), le U1sh7 a été sélectionné pour une étude plus approfondie sur un panel élargi de variantes. Des expériences de co-transfection ont montré que l’U1sh7 sauvait remarquablement les variantes c.669A > G, c.669A > T et c.670G > T (> 80% des transcriptions correctes), et semblait également avoir un effet de correction (de 0% à ∼40%) sur celles aux positions +1 (c.670 + 1A) et +2 (c.670 +2G) conservées (Figure 2B).

L’apparition inattendue de transcrits d’une taille compatible avec un épissage correct même pour les mutants aux positions +1 et +2 nous a incités à analyser plus avant le résultat de l’épissage par marquage fluorescent des amplicons suivi d’une électrophorèse capillaire dénaturée (Figure 3 et Figure supplémentaire 3). Cette approche, dans les cellules exprimant seules les variants +1 et +2, a révélé la présence de niveaux de traces de transcrits aberrants ne différant que pour quelques nucléotides (-1, +1 et +4 pb). En particulier, les transcriptions aberrantes -1 et +1 n’ont été identifiées que dans le c. 670 +1T et c.Contexte 670 + 2G (7,1 ± 2,4% et 1,3 ± 0,7%, respectivement), tandis que la transcription + 4 a été détectée pour le mutant c.670 + 1T (1,1 ± 0,8%), c.670 + 2G (1,4 ± 0,8%) et c.669T (1 ± 0,6%).

Grâce à cette approche, nous avons ensuite évalué l’effet de l’U1sh7, qui a réorienté le splicéosome sur la jonction exon-intron, comme l’indiquent les transcrits généralement diminués résultant de l’utilisation des 5’s cryptiques distaux. Cependant, en raison des mutations aux positions cruciales, l’U1sh7 a forcé l’utilisation des 5’s cryptiques adjacentes, créées / renforcées par des mutations, et a remarquablement augmenté la proportion de +4 formes pour les formes c.670 + 1T (de 1,1 ± 0,8 à 72,6 ± 2,2%) et c.670 + 1A (de 0 à 55,3 ± 2,1%) et + 1 pour les formes c.670 + 2G (de ∼ 1% à334%) variantes.

Concernant les autres mutants, l’électrophorèse capillaire dénaturante nous a permis de compléter l’évaluation correcte du sauvetage médié par U1sh7 sur le panel de mutations sélectionné. Comme le montre la figure 3B, la co-expression de l’U1sh7 a conduit à une proportion sensiblement accrue de transcriptions correctes pour la variante c.602-10T >G aux 3’s et les variantes c.669A > T, c.669A >G, c.670G >T, c.670 +5G >A et c.670+6T aux 5’S. sss.

Pris ensemble, nos données ont disséqué davantage les schémas d’épissage aberrants associés aux mutations responsables de l’HA et ont identifié un ExSpeU1 unique capable de sauver de multiples mutations, à l’exception de +1/+2 variantes souffrant d’un contexte défavorable.

Discussion

L’avènement du séquençage de nouvelle génération a considérablement augmenté le nombre de variations génétiques associées aux maladies humaines, posant ainsi le problème de l’identification des causes. Ceci est particulièrement difficile pour les changements nucléotidiques qui, étant aux limites exon-intron ou à l’intérieur des introns, sont susceptibles d’affecter l’épissage car leur effet précis n’est guère prévisible par les outils de calcul. Le scénario est encore compliqué par les codes d’épissage et d’acides aminés chevauchés dans les exons, ce qui pourrait conduire à des changements faux sens exerçant leur rôle pathogène en modifiant le processus d’épissage plutôt que la biologie des protéines (Tajnik et al., 2016; Donadon et coll., 2018a).

Dans ce contexte, l’évaluation expérimentale de l’impact des modifications nucléotidiques sur l’épissage est obligatoire pour aider au diagnostic et au conseil. Ici, nous avons abordé cette question dans un contexte génétique singulier, à savoir l’exon 5 F8, où divers changements exoniques et de multiples 5’s cryptiques sont respectivement situés à l’intérieur ou à proximité des 5’s authentiques, compliquant ainsi la sélection du bon.

L’analyse du schéma d’épissage du c.Le changement nucléotidique de 602-10A > G, avec des niveaux appréciables (∼38%) de transcrits correctement épissés, est compatible avec le phénotype de coagulation légère rapporté chez le patient. Inversement, les variants faux sens c. 602G > A (p. G201E), c.655G > A (p.A219T) et c.667G > A (p. E223G) ne sont pas associés à des altérations significatives de l’épissage, ce qui indique que le déficit en FVIII est principalement causé par les substitutions d’acides aminés sous-jacents altérant la biosynthèse / la fonction des protéines. Cette observation est également renforcée par les données avec des U7SNRNA antisens qui ne supportent pas la présence d’éléments exoniques régulateurs importants dans l’exon 5 F8, qui pourraient avoir été modifiés par des changements exoniques. Cependant, à proximité des 5’s, le code d’épissage chevauche le registre des acides aminés, celui d’épissage étant le premier utilisé dans le flux d’expression génique. En ce qui concerne les mutations se produisant dans les 5’s, il convient de noter que les variantes exoniques c. 669A > G (p. E223E), c. 669A > T (p. E223D) et c. 670G > T (p. G224W) modifient clairement l’épissage. Considérant que le c.669A > T est principalement associé au saut d’exon et à la perte de définition d’exon, les variantes c.669A > G et en particulier les variantes c.670G > T conduisent à une rétention partielle de l’intron, avec l’utilisation d’un 5’s intronique fort en position +177. De manière notable, l’analyse d’épissage de variants à différentes positions du même triplet (c. 667G > A, c.669A > G et c.669A > T) codant pour l’acide glutamique en position 233 dans le FVIII a donné des résultats d’épissage différents, allant du saut d’exon à l’utilisation de l’épissure cryptique 5’s ou null. Cette découverte met en évidence la nécessité d’une évaluation minutieuse des effets des changements exoniques sur l’épissage, en raison de l’aide limitée de l’analyse bioinformatique pour prédire la pathogénicité des changements nucléotidiques. Il convient de noter que les niveaux de transcriptions correctes pour les variants c.669A > T (p. E223D) (∼40%) et c.670G > T (∼10%) suggèrent que le déficit associé en FVIII (modéré / sévère) proviendrait d’une combinaison d’épissage et d’altération des protéines. D’autre part, les mutations aux positions introniques +1/+2/+5 n’étaient pas compatibles avec un épissage correct. Différemment, la variante +6 a conduit à des niveaux remarquables de transcrits correctement épissés, conformément aux phénotypes de coagulation sévères ou légers rapportés chez les patients atteints d’HA, respectivement.

La connaissance des schémas d’épissage aberrants jette les bases de l’exploration d’approches de correction à des fins thérapeutiques, comme nous l’avons fait dans plusieurs autres modèles de maladies humaines. L’intervention au niveau de l’ARNm présente l’avantage de maintenir la régulation génétique physiologique et repose sur la délivrance de petites cassettes codantes, permettant ainsi l’exploitation de toute stratégie de vecteur viral. Parmi les différentes stratégies, les ARNU1 modifiés ont démontré la capacité de sauver plusieurs types de mutations, y compris des changements à 5’ss, 3’ss ainsi qu’à l’intérieur des exons, dans des modèles cellulaires et animaux de maladies humaines (Glaus et al., 2011; Schmid et coll., 2011; Balestra et coll., 2014; Balestra et coll., 2015; van der Woerd et coll., 2015; Dal Mas et coll., 2015a; Dal Mas et coll., 2015b; Balestra et coll., 2016; Rogalska et coll., 2016; Tajnik et coll., 2016; Scalet et coll., 2017; Scalet et coll., 2018; Donadon et coll., 2018b; Donadon et coll., 2019; Scalet et coll., 2019). De manière notable, il a été démontré que les U1SNRNA modifiés préservaient leur effet de correction même lorsqu’ils ciblaient des régions introniques en aval de l’exon défectueux (ExSpeU1) grâce à un mécanisme qui, contrairement aux oligonucléotides antisens bloquant un élément intronique, implique l’assemblage d’U1snRNP, l’activation de l’épissure et le recrutement de facteurs d’épissage (Martínez-Pizarro et al., 2018; Rogalska et coll., 2016). De plus, cette deuxième génération d’U1SNRNA modifiés assure potentiellement une spécificité d’exons et de gènes plus élevée puisque leur capacité d’appariement de bases avec des séquences introniques, et donc moins conservées, comme le confirment des études récentes (Donadon et al., 2019; Rogalska et coll., 2016). Néanmoins, l’effet hors cible de chaque ExSpeU1 doit être soigneusement évalué lors de l’approche des cliniques.

Dans le contexte de l’exon 5 F8, nous avons identifié un ExSpeU1 capable de restaurer une définition correcte de l’exon en présence de mutations multiples, situées à la fois en 3’s ou en 5’s. Fait intéressant, nous avons observé que les variantes en position +1 et +2 de 5’s, qui ne pouvaient pas être sauvées par l’ARNU U1SNR modifié en raison de leur degré élevé de conservation, ont abouti à des transcriptions de taille comparable à celle des transcriptions correctement épissées. Récemment, il a été démontré que la transition T>C en position +2 de 5’ss pouvait être sauvée par un ARNR U1SN modifié (Scalet et al., 2019), une conclusion compatible avec l’observation selon laquelle une petite fraction des introns éliminés par un splicéosome de type U2 contient de la cytidine en position +2 (Burset et al., 2000). Il existe également des exemples de mutations en position +1 compatibles avec un traitement correct (Hartmann et al., 2010), qui ouvrent potentiellement la possibilité de les sauver. Ici, pour disséquer le caractère insaisissable des transcrits, nous avons exploité l’électrophorèse capillaire dénaturante, une stratégie capable de distinguer les amplicons ne différant que par un seul nucléotide. L’analyse des motifs d’épissage a révélé l’utilisation de 5’s cryptiques créés par des mutations (c. 670 + 1G > T et c. 670 + 2T > G) conduisant à des transcriptions respectivement plus courtes ou plus longues d’un seul nucléotide. Malheureusement, en raison du registre modifié des 5’s, l’ExSpeU1 a favorisé l’utilisation des 5’s autres que l’authentique, faisant ainsi disparaître l’effet de correction.

En conclusion, grâce à la caractérisation moléculaire de diverses variantes de l’exon 5 F8 se produisant au niveau des 3’s ou des 5’s, ou à l’intérieur de l’exon, nous avons démontré pour la première fois la capacité d’un ExSpeU1 unique à sauver de multiples mutations F8 à l’origine de l’HA. De plus, nos résultats soulignent la nécessité d’étudier l’effet sur l’épissage des changements nucléotidiques, en particulier de ceux qui se produisent dans les séquences exoniques, et suggèrent une inspection minutieuse du contexte de la séquence et une évaluation des transcriptions pour éviter les interprétations excessives, avec des implications pour le diagnostic et le conseil.

Énoncé de disponibilité des données

Tous les ensembles de données générés pour cette étude sont inclus dans les fichiers manuscrits/supplémentaires.

Déclaration d’éthique

L’approbation éthique de cette étude n’était pas requise conformément à la législation locale. Néanmoins, l’échantillon d’ADN du patient témoin a été utilisé après l’obtention du consentement éclairé.

Contributions des auteurs

Tous les auteurs ont contribué de manière significative au manuscrit. Le manuscrit a été conçu et préparé par DB, MP et FB. IM a effectué l’analyse d’électrophorèse capillaire et AB, MF et DB ont effectué les expériences. Dans l’ensemble, la clarté du manuscrit a été examinée par tous les auteurs et tous ont approuvé son contenu.

Financement

Les auteurs souhaitent souligner le soutien apporté par le Programme de Prix Bayer pour l’hémophilie en début de carrière (BHAP 2017, DB).

Conflit d’intérêts

MP est l’inventeur d’un brevet (PCT/IB2011/054573) sur les U1SNRNA modifiés.

Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières pouvant être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Matériel supplémentaire