백혈병 마우스 스트레인(법 등., 1949). 세포는 쥐에 있는 연속되는 이식에 의해 유지되고 1966 년에 생체외 문화 체계에서 두고,1979 년에 미국 유형 문화 수집에서 예금되었습니다(무어 외., 1966). 1977 년에 처음 설명되었다. 1977)및 박사 이스트만에서 얻은(다 머스,미국). 이 L1210/S 서브 라인에 의해 주어진 Dr S 크로(툴루즈,프랑스),에서 얻을 수 있었 복수 유체의 여성 DBA/2 쥐입니다.
두 세포주에 대해 지문을 실시하여 이들 세포주가 유전적인지 확인하였다(그림 1). 추정되는 바와 같이,유전자 지문 프로파일은 이 두 세포주에 대한 일반적인 종양 기원을 지지하는 매우 유사하였다.
그림 1
1210 세포의 지문입니다. 1210/0(2)및 1210/에스(3)세포의 제한 엔도 뉴 클레아 제 다이제스트의 서던 블롯과 혼성화 하였다. 십 µg 샘플의 DNA 었으로 소화 BstNI,HinfI,또는 HaeIII. 비관용 유전자 제어로 사용됩니다.
2010 년 12 월 1 일,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과,스타우로스포린-유도 세포사멸에 대한 지연된 반응을 조사한 결과, 이 농도에서 스타우로스포린은 1210/에스 세포 생존력에서 현저한 감소(80%)를 유도했다(그림 2 에이,레인 2 처리되지 않은 세포에 비해,레인 1). 이 생존 능력의 손실은 세포 사멸의 특징 인 핵간 사다리 패턴을 가진 유전자 분열과 관련이 있습니다. 반면,동일한 조건(농도 및 노출)에서 스타우로스포린은 세포 생존력의 유의 한 손실이나 유전자 단편화를 유발하지 않았다. 그러나,12 시간 동안 이들 세포의 연장된 노출은(도 2 에이,레인 10)세포 생존력의 현저한 감소를 유도하였다(노출 12 시간에서 80%에 비해 노출 3 시간에서 10%). 따라서,스타우로스포린-유도 세포사멸은 엘 1210/0 세포에 비해 엘 1210/에스 세포와 지연되었다.
그림 2
세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 의한 세포 사멸에 대한 세포에서 치료를 했 37°C staurosporine(5μm)또는 caspase 억제제,Z-VAD-fmk(400µM). 스타우로스포린을 첨가하기 1 시간 전에 세포 배양에 첨가하였다. 대조군 실험은 단독으로 수행되었다. 1)대조군(상부 패널)에 의해 처리되지 않은 대조군(상부 패널)에 비해 생존율은 3 시간(엘 1210/에스 및 엘 1210/0)에서 결정되었다. 각 점은 세 가지 독립적 인 실험의 평균을 나타냅니다. 처리 후,세포를 수확 하 고 재료 및 방법(하단 패널)에 설명 된 대로 유전자 단편화 분석 했다. (2)카스파 제-3 유사 효소 활성은 재료 및 방법(상부 패널)에 설명 된 바와 같이 분광 광도계에 의한 가수 분해의 측정에 의해 분석되었다. 효소 활동 초기 속도로 측정 하 고 상대 강도/분/밀리 그램 총 단백질로 표현 했다. 원유 lysates 에서 준비 했 L1210/S L1210/0 세포 및 분석 서 blotting(낮은 패널)가진에 대한 항체를 PARP 및 lamin B.PARP(116kDa)및 Lamin B(60kDa)are proteolytically cleaved 동안 caspase-dependent apoptosis. PARP 및 Lamin B cleavages 의 각각의 85 45kDa 단백질 조각 명확하게 표시 staurosporine L1210/S 처리 cells. 각 차선에는 같은 양의 단백질(15 개)이 들어 있습니다.그램). (C)의 평가 apoptosis 의 L1210 세포 후 수 있습-Grunwald-Giemsa 염색(상부 패널)에 의하여,dapi 에서 염색(중판),또는 Annexin V 염색(낮은 패널). 또한,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,실시예에 따라,실시예에 따라,실시예에 따라,실시예에 따라,실시예에 따라, 치료 후,세포를 아넥신-핏으로 표지하고 형광 활성화 세포 분류기에 의해 분석 하였다. 각 패널의 백분율은 증가 아넥신 브이 결합을 나타내는 세포의 수를 나타낸다. 10 천개의 세포는 각 조건 하에서 분석되었습니다
세포 사멸에 의해 매개되는 대부분의 형태의 세포 사멸은(코헨,1997)의 단백질 분해 작용에 의해,우리는 먼저 차동 적으로 관여 할 수있다 세포 사멸 효과기에 대한 통찰력을 얻기 위해 카스파 제의 참여를 조사 하였다. 세포 치료를 했 staurosporine(5μm)에서 존재의 강력한 세포 투과성 caspase 억제제,Z-VAD-fmk(200μm),다음 분석을 위한 apoptosis 유도하고 DNA fragmentation. 1996)의 광범위 한 스펙트럼을 억제 하 고 카스 파 제의 촉매 사이트에 의사 기판으로 결합 하 여 아폽토시스의 다양 한 형태를 차단 하는 것으로 나타났습니다., 1995). 세포 사멸 및 단편화를 보호 한 반면(그림 2 에이,레인 4),스타 우로 스포린에 대한 12 시간 노출에 대한 어떠한 보호도 제공하지 않았다(그림 2 에이,레인 12). 세포사멸은 세포사멸(그림 2 에이,레인 12 및 씨)의 특징인 형태학적(세포수축 및 염색질의 응축)과 생화학적 특징 모두의 존재에 의해 나타난 바와 같이 세포사멸 유형이었다. 흥미롭게도,이 결과는 원형질막에 대한 포스파티딜 세린 외부화가 카스파 제 활성화가없는 경우에 발생할 수 있음을 보여줍니다. 따라서,이전의 결과와 대조적으로(코엘료 외. 2000;허쉬 외., 1997; 르메르 등. 1998;사르와 베르트랑,1999;김 외.,2000),카스파 제 억제는 스타 우로 스포린 유발 세포 사멸을 세포 사멸에서 괴사로 전환시키지 않았다. 이러한 결과 제안,스타우로스포린 유도 세포 사멸과 디 유전자 단편화 필요한 카스파 제 활성화 엘 1210/에스 세포,이 메커니즘 유도에 대 한 사용 되지 않은 디 유전자 단편화 및 아폽토시스 엘 1210/0 세포 스타우로스포린에 의해 처리. 또한,카스파 제 1210/0 세포에서 스타 우로 스포린 유도 세포 사멸이 카스파 제 독립적 인 경로를 통해 진행된다는 사실은 카스파 제 독립적 인 세포 사멸이 카스파 제를 활성화시키고 세포 사멸을 유도하는 능력에도 불구하고 다른 약물(시스플라틴,에토 포사이드)에 의해 엘 1210/0 세포에서 유도 될 수 있기 때문에 사용되는 약물에 특이하지 않습니다.1167>
스타우로스포린이 카스파제를 활성화시키는 능력을 시험하기 위해,스타우로스포린-처리된 엘 1210/에스 및 엘 1210/0 세포 모두에서 카스파제-3 유사 활성에 대해 제조 및 분석 하였다. 10 배 이상의 카스파제-3 유사 활성을 보였다(그림 2 비,레인 2). 억제제의 존재 하에서,데브다아제 활성은 기록되지 않았다(그림 2 비,레인 4). 이 결과는 카스파 제 3 유사 프로테아제가 스타 우로 스포린-유도 세포 사멸에 따라 활성화된다는 것을 확인한다. 대조군 세포로부터의 세포 용 해물에서 검출 된 것과 유사한 카스파 제-3 유사 활성의 수준을 특징으로한다(그림 2 비,레인 6 및 10,각각).1999 년 10 월 11 일에 확인함.
유전자 복구에 그것의 역할 때문에 게놈의 무결성을 보전에 연루 된다. 따라서이 효소는 세포 사멸에서 검사되었으며 카스파 제 -3 및 -7 에 대한 기질로 확인되었습니다. 1994;오르트 외., 1996; 다카하시 외., 1996). 세포 사멸에서 초기 단계에서 116-세포 사멸에서 85-세포 사멸 형태로의 파프의 절단이 검출 될 수있다. 또한,이 세포들은 다른 세포들과 비교될 수 있다. 이 경우,처리 된 세포 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 용 해물 중 하나 또는 두 개의 또한,세포 내에서의 세포 분열을 억제하고,세포 내에서의 세포 분열을 억제한다.
시험관 내에서 카스파 제-3 는 카스파 제-6 을 처리 할 수 있는데,이는 핵이 여러 세포 사멸체로의 분열에 필요한 절단이 필요한 라민의 단백질 분해를 담당합니다., 1995). 라민 비의 절단은 엘 1210/에스 처리 된 세포로부터 제조 된 용 해물에서 명확하게 검출되었지만 엘 1210/0 처리 된 세포로부터의 용 해물에서는 검출되지 않았다(그림 2 비). 이 절단은 치료에 의해 억제되었다.1167>
스타우로스포린 치료는 두 세포주 모두에서 아폽토시스를 초래했지만,스타우로스포린에 3 시간 동안 노출된 1210/에스 세포에서만 사망을 막았다. 따라서 스타 우로 스포린은 두 개의 독립적 인 경로로 세포 사멸을 유도 할 수있었습니다. 하나는 빠른(엘 1210/에스 세포)및 카스파 제 의존성,다른 하나는 느린(엘 1210/0 세포)및 완전히 카스파 제 독립.1167>
아폽토시스에 대한 느린 카스파제-독립 경로가 또한 존재 엘 1210/에스 세포
우리는 엘 1210/0 세포에서 입증 된 느린 아폽토시스 카스파제-독립 경로가 엘 1210/에스 세포에도 존재했는지 궁금합니다. 이 가설을 시험하기 위해,빠른 카스파 제 의존성 세포 사멸 경로를 완전히 차단하기 위해 12 시간 동안 5 개의 스타 우로 스포린을 400 개의 스타 우로 스포린으로 처리 하였다. 세포 사멸은 모든 형태 학적 및 생화학 적 분석을 불가능하게 만들었다. 세포 사멸의 60%이상,핵간 분열과 관련된 세포 사멸이 관찰되었다(그림 3 에이,레인 3). 그러나,이 세포 사멸 동안 카스파 제-3 와 같은 활성화,또는 파프 또는 라민 비 분열은 관찰되지 않았다(그림 3 비,레인 3). 또한,세포 사멸은 세포 사멸의시기의 형태 학적 및 생화학 적 특징을 나타냈다(그림 3 에이,레인 3 과 씨,비)효과적인 카스파 제 억제에도 불구하고. 이 경우 또한,카스파 제 억제는 따라서 스타 우로 스포린-유도 된 세포 사멸을 세포 사멸에서 괴사로 전환시키지 않았다. 따라서,카스파 제 활성이 차단 된 경우,스타 우로 스포린으로 12 시간 치료가 카스파 제 독립적 인 세포 사멸을 유발했다.
그림 3
세포 사멸에 의한 세포 사멸에 대한 형태 학적 및 생화학 적 분석. 12 시 37 분부터 카스파 제 억제제와 함께 스타 우로 스포린(5,000,000,000,000)으로 세포를 처리 하였다. 이 경우,세포 내 투여 후 1 시간 이내에 투여 할 수 있습니다. 대조군 실험은 단독으로 수행되었다. 세포 사멸은 모든 형태 학적 및 생화학 적 분석을 불가능하게 만들었다. (2)카스파제-3 유사 효소 활성(상부 패널)및 파프 및 라민의 절단 비(하부 패널)는 도 2 에서와 같이 분석 하였다. (다)5 월-그룬 발트-김사 염색 후 또는 다피 염색 후 세포의 세포 사멸에 대한 형태 학적 평가. 1200 의 존재하에 5 개의 스타우로스포린 12 시간으로 처리 하였다.
이러한 프로테아제 유전자 발현의 결함으로 인해 카스파제의 발현을 위한 다중 프로베 템플릿을 사용한 연구실험 -1, -2, -3, -6, -7, -8, -11, -12 수행되었다(그림 4). 이 분석에는 구성 유전자,글리 세르 알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 및 리보솜 엘 32 보호 된 리보솜 하이브리드의 상대적 정량화에 대한 연구가 포함되었습니다. 카스파 제 성적 증명서의 발현은 엘 1210/0 과 엘 1210/에스 세포에서 비교되었다. 이 분석은 카스파 제-6 및-7 의 발현 수준이 엘 1210/0 세포에서 최소임을 보여주었습니다. 그러나,카파 제-3 및-8 의 식 수준에 유의 한 차이 두 셀 라인에서 볼 수 있었다. 이 실험은 비록 엘 1210/0 세포에서 카스파 제 활동의 일부 결함 전사 수준에서 결함으로 인해 발생할 수 있습니다,그들은 카스파 제 활동의 완전 한 부재를 설명 하기 위해 충분 하지 않습니다 나타냅니다.
그림 4
2018 년 11 월 15 일-2018 년 11 월 15 일 1210/0 및 1210/에스 세포주로부터 분리되고,1210/에스 세포주에 의해 소화되기 전에 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 다중 프로베와 혼성화되었다. 보호된 단편을 변성 아크릴아마이드 겔 상에서 분리하였다. 조각 할당은 보호되지 않은 표준을 기준으로 마이그레이션 거리에 의해 결정되었습니다. 리보솜의 발현 수준 32 세포 글리 세르 알데히드-3-포스페이트 데 히드로 게나 제(갑 디드)는 내부 통제뿐만 아니라 효모로 수행 된 효모로 작용합니다.
상기 실험에서 카스파제-3 및 -8 성적표가 둘 다에서 발현되었지만,아폽토틱 엘 1210/0 세포는 카스파제 활성에서 결함이 있음을 보여 주었다. 이것은 단백질 수준에 이 프로테아제를 표현하는 실패,또는 아폽토시스 도중 그(것)들을 활성화하는 실패를 반영합니다. 또한,카스파 제의 신속하고 일시적인 활성화의 경우,그들의 활동 피크를 놓칠 수있었습니다. 따라서,아폽토시스의 스타 우로 스포린 유도 후 두 세포주에서 카스파 제 -3,-6,-7 및-8 의 존재 및 처리를 시험 하였다. 도 5 는 카스 파제-3,-6,-7 및-8 의 32,32,35 및 55 를 각각 나타내었다. 이들 세포의 스타우로스포린 처리는 프로-카스파제-6 및-7 의 손실 및 카스파제-3 의 처리 된 서브 유닛의 출현에 의해 입증 된 바와 같이 카스파 제-3,-6 및-7 의 성숙을 유발했다. 이 세포주에서는 스타우로스포린 치료가 이 카스파제를 활성화시키지 않았음을 나타낸다.
그림 5
카스파 제 처리 분석. 1210 및 1210/0 세포로부터 제조된 동일한 양의 추출물(15)을 각각 3 및 12 시간 동안 5 스타우로스포린으로 처리하거나 처리하지 않은 세포로 분해하고,재료 및 방법에 따라 설명된 바와 같이 항–카스파제-3,-6,-7 및 -8 항체로 프로빙하였다. 처리 된 카스파 제 -3 및 -8 서브 유닛과 함께 프로 카스파 제 -3,-6,-7 및 -8 레벨이 표시됩니다. 카스파 제-3 및-8 의 활성화는 프로폼(각각 32 및 55)의 강도의 적당한 감소와 17(카스파 제-3)및 43(카스파 제-8)에서 밴드의 출현을 특징으로 하였다. 카스파 제-6 과 -7 활성화는 32 의 실종으로 이어졌다. 미처리 및 스타우로스포린-처리된 유르캇 세포로부터 제조된 용해물을 카스파제-8 활성화를 위한 양성 대조군으로 포함시켰다. 이 세포주에서 스타 우로 포린은 처리 된 서브 유닛 카스파 제를 유도했습니다-8
카스파제-6 도 카스파제-7 도 대조군으로 발현되지 않았거나 치료된 엘 1210/0 세포. 또한,프로카스파제-3 및-8 이 엘 1210/0 대조군 세포에서 검출되었지만,스타우로스포린-유도 세포사멸에 따른 어떠한 처리도 유도되지 않았다.1167>
따라서,스타우로스포린-유도 세포사멸에서의 카스파제 활성화의 면역블롯 증거는 카스파제 활성의 측정 및 카스파제 기질 절단(라민 비 및 파프)의 검출을 입증하는데,이는 처리된 카스파제가 기능적으로 활성이었음을 나타낸다. 다른 한편으로,아폽토시스 엘 1210/0 세포에서 카스파 제 활성화의 부재는 카스파 제 활성 및 기질 절단,이 세포주에서 아폽토시스가 카스파 제 독립적 인 경로에서 발생했음을 나타내는 부재와 일치합니다.
결론
우리는 이전에 서로 다른 1 차 표적을 갖는 약물에 반응하여 세포 사멸이 서로 다른 신호 경로를 통해 작용할 수 있음을 보여 주었다. 본 결과는 동일한 약물(스타 우로 스포린)이 세포의 효소 장비에 따라 세포 사멸의 적어도 두 가지 신호 전달 경로를 유도 할 수 있음을 보여줍니다(그림 6). 첫 번째 것은 빠르며(<3 시간)카스파 제의 활성화를 수반하는 반면,두 번째는 느리다(>12 시간)카스파 제와 독립적이다. 시간 차이와 카스파 제 침범의 차이에도 불구하고,두 가지 형태의 스타 우로 스포린 유도 세포 사멸은 세포 사멸을 초래합니다. 이 두 경로는 일반적으로 엘 1210/에스 세포,반면 느린 카스파 제 독립적 인 경로 만 발생합니다 엘 1210/0 세포,카스파 제 활성화의 일반적인 결함으로 인해. 이 결함은 분명히이 클론에서 자발적으로 개발되었으며,그러한 자발적인 획득이 지금까지 인정 된 것보다 종양에서 더 일반적으로 발전 할 수 있다고 추측 할 수 있으며,항암 성 표현형을 유도 할 수 있습니다. 세포자멸을 위한 이 두 경로는 둘 다 스타우로스포린 처리한 헥톨륨 60 세포에서 또한 공존하기 때문에 엘 1210/에스 세포에 특정적이지 않았습니다. 그러나 카스파 제 활성화에 의존하는 경로 만이 스타 우로 스포린 처리 된 유르 캇 세포(벨 모크 타르 등)에 존재했다. 2001,미공개 결과).
그림 6
스타 우로 스포린은 세포 사멸의 두 가지 신호 경로를 유도합니다. 그 중 하나는 급속하고 카스파 제 의존적이며 세포 내에서 발생합니다. 다른 하나는 더 느리고 카스파 제-독립적이며 일반적으로 카스파 제 활성화에 결함이있는 엘 1210/0 세포에서 발생하며,또한 엘 1210/에스 세포 제공 카스파 제 활성화가 억제되었습니다.
우리의 연구는 카스파 제 활성화가 약물에 대한 세포의 내재 저항을 결정하는 데 분명히 중요하다는 것을 보여주는 이전 결과와 일치합니다(로스 외., 1997). 여기 보고 된 1210 세포 모델(그림 6),차별화,아폽토시스,명확 하 게 하지 않은,그에서 카스파 제 활성화와 관련 된 이벤트 및 셀 카스파 제 종속 또는 카스파 제 독립적인 메커니즘을 입력 여부를 결정 하는 요소를 식별 하는 유용한 도구를 제공 합니다. 세포가 하나 또는 다른 메커니즘을 사용하기 위해 어떻게 조작 될 수 있는지에 대한 우리의 이해는 종양 세포 사멸을 삼가기위한 화학 요법 제를 더 잘 활용하는 데 도움이 될 것입니다.
