Frontiers in Genetics

introduktion

i högre eukaryoter sprids den information som behövs för proteinsyntes över genen, där de kodande segmenten (exoner) representerar en mindre andel. Därför är exon-igenkänningen och avlägsnandet av de icke-kodande sekvenserna (introner) från pre-mRNA väsentliga för korrekt genuttryck, och denna process (skarvning) utförs av ett enormt makromolekylärt komplex som heter spliceosome. Det första steget i spliceosome-enheten innefattar bindning av det lilla nukleära ribonukleoproteinet U1 (U1snRNP) till 5′ skarvplatsen (5′ SS) genom komplementaritet med 5 ‘ svansen av dess RNA-komponent, U1snRNA (Roca et al., 2005). Inte överraskande är nukleotidförändringar som uppträder vid 5 ‘ s, genom att störa dess erkännande och så småningom leda till avvikande skarvningshändelser, vanligtvis associerade med allvarliga kliniska fenotyper och rapporteras allmänt (9%) i humana ärftliga sjukdomar (http://www.hgmd.org/). Denna information ledde oss att utveckla en korrigeringsstrategi baserad på u1snrnas-varianter utformade för att återställa komplementariteten med den muterade 5 ‘ SS (kompensatorisk U1snRNA) (Pinotti et al., 2009). Oväntat visade vi också korrigeringspotentialen för konstruerade U1snRNAs som riktar sig mot introniska sekvenser nedströms den defekta exonen (Exonspecifika U1snRNAs; ExSpeU1), som är aktiva på mutationer som uppträder vid 5 ‘s, 3’ S såväl som inom exon (Alanis et al., 2012). Effekten har bevisats både i flera cellulära (Glaus et al., 2011; Schmid et al., 2011; Balestra et al., 2015; van der Woerd et al., 2015; Dal Mas et al., 2015a; Dal Mas et al., 2015b; Rogalska et al., 2016; Tajnik et al., 2016; Scalet et al., 2017; Scalet et al., 2018; Balestra et al., 2019; Balestra och Branchini, 2019; Scalet et al., 2019) och djur (Balestra et al., 2014; Balestra et al., 2016; Rogalska et al., 2016; Donadon et al., 2018b; Donadon et al., 2019; Lin et al., 2019) modeller av mänsklig sjukdom.

exon-definitionen är dock mycket komplex och förutom skarvplatserna involverar en serie skarvreglerande element, vilket leder till valet av rätt skarvkorsningar och missgynnar användningen av de flera kryptiska skarvplatserna (De Conti et al., 2013). Beroende på sammanhanget kan nukleotidförändringar därför utlösa olika avvikande skarvningsmekanismer med vilka korrigeringsmetoder, såsom u1snrna-medierad, måste klara sig.

här utmanade vi ExSpeU1s i F8 exon 5 som en modell av sammanhang där den autentiska 5 ‘SS omges av olika kryptiska 5’ SS (Figur 1a), ett scenario som ytterligare kompliceras av förekomsten av nukleotidförändringar vid 5 ‘ SS som är associerade med koagulationsfaktor VIII (FVIII) brist (hemofili A, HA) (Bolton-Maggs och Pasi, 2003). Minigene-expressionsstudier indikerade att dessa förändringar förändrar det känsliga samspelet mellan 5 ‘ SS, vilket tydligen kan balanseras av en ExSpeU1 som riktar sig mot en intronisk sekvens nedströms. Den djupa undersökningen av de räddade transkripten från +1 och +2-varianterna avslöjade emellertid att ExSpeU1 omdirigerade användningen av den nyskapade kryptiska 5 ‘ ssoch därmed försvann korrigeringsförsöket. Dessa data visar tillämpligheten av ExSpeU1 till ha-orsakande mutationer och stärker betydelsen av sekvenskontexten för att diktera skarvningsresultatet.

material och metoder

skapande av uttrycksvektorer

för att skapa pf8wt-plasmid, den genomiska regionen av den humana F8-genen (Nc_000023.11) som spänner från c.602-464 till c.670+773 förstärktes från genomiskt DNA hos ett normalt ämne med primers i4F-i5R med hjälp av high-fidelity Pfu DNA-polymeras (Transgenomic, Glasgow, UK). F8 amplicon klonades sekventiellt i PTB-uttrycksvektorn (gåva av prof. F. Pagani, ICGEB, Trieste, Italien) genom att utnyttja ndei-begränsningsstället.

uttrycksvektorerna pU1F8d, pU1F8s7, pU1F8s16, pU1F8s25 för de modifierade u1snrna skapades genom att ersätta sekvensen mellan bglii-och xbai-restriktionsställena med en PCR genererad med en U1-specifik framåtprimer (innehållande den modifierade 5′ – svansen på U1snRNA) och en omvänd primerbasparning nedströms XbaI-kloningsstället.

pU7a -, b -, c -, d-uttrycksvektorerna för de modifierade U7snrna skapades som tidigare rapporterats (Balestra et al., 2015). I korthet har en PCR innehållande det modifierade bindningsstället för det konstruerade U7snRNA genererats genom att använda primrarna som anges i kompletterande Tabell 1 och klonas in i psp64-plasmid (gåva från Franco Pagani, ICGEB, ita) efter matsmältning med StuI-och XbaI-restriktionsställen.

alla vektorer har validerats genom sekvensering.

sekvenser av oligonukleotider anges i kompletterande Tabell 1.

uttryck i däggdjursceller och mRNA-studier

humana Embrioniska njure 293t (HEK293T) celler odlades som tidigare beskrivits (Farrarese et al., 2018). Celler såddes på tolv brunnsplattor och transfekterades med Lipofektamin 2000-reagenset (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll.

femhundra nanogram av pf8-minigenvarianter transfekterades ensamma eller med ett molärt överskott (1,5 X) av pU1/pU7-plasmiderna. Totalt RNA isolerades 24 timmar efter transfektion med Trizol (Life Technologies), omvänd transkriberas med slumpmässiga primers och amplifieras med hjälp av Pfu DNA-polymeras (Transgenomic, Glasgow, UK) med primers Alfa och Bra. Samma DNA-polymeras och primers 4F och 8R användes för att utvärdera F8-skarvningsmönstren i mänsklig lever. Densitometrisk analys för kvantifiering av korrekta och avvikande transkript utfördes med hjälp av ImageJ-programvaran (https://imagej.net).

för denaturering av kapillärelektroforesanalys märktes de förstärkta fragmenten med användning av primers Alfa och den fluorescerande märkta (FAM-färgämnet) bh och kördes på ett ABI-3100-instrument (Waltham, MA, USA).

tre oberoende experiment utfördes för varje variant och tillstånd.

Beräkningsanalys

Beräkningsförutsägelse av skarvplatser och av skarvningsreglerande element utfördes med hjälp av Human Splicing Finder (www.umd.be/HSF/) online-programvara.

resultat

Beräkningsanalysen förutsäger flera konkurrerande 5 ‘SS

bioinformatisk analys (www.umd.be/HSF3/index.html) förutspår att F8 exon 5 är väldefinierad, vilket framgår av de höga poängen för 5 ‘SSS och 3’ SSS (94,02 respektive 94,62) (Figur 1a). Dessutom förutspår den tre kryptiska 5 ‘ s i intron 5, två av dem belägna vid nukleotidpositioner +65 och +177 bp, och en i närheten (+5) av den autentiska. Alla har en poäng (81, 85 och 96 för +5, +65 respektive +177 kryptiska 5 ‘SS) nära den för den autentiska 5’ SS och, baserat på hsf-matrisen, över tröskeln på 80.

detta gav oss en informativ modell för att bedöma 5 ‘ SS konkurrens och avvikande splicing mekanismer samt lämpligheten av ExSpeU1 som en korrigering strategi.

F8 Exon 5 Nukleotidförändringar leder till avvikande skarvning, allt från Exonhoppning till användning av kryptisk Intronic 5 ‘ SS

för att undersöka skarvningsmekanismer i F8 exon 5-sammanhanget skapade vi en F8 minigene inklusive F8 exon 5 och de omgivande intronerna (Figur 1b). Uttryck av den vilda typen (wt) minigene i HEK293T-celler indikerade att exon 5 är väldefinierad, och detta mönster rekapitulerar den fullständiga inkluderingen som observerats i human lever mRNA (figur 1C), vilket validerar vårt experimentella tillvägagångssätt.

eftersom även exoniska nukleotidförändringar såsom missense-mutationer kan påverka skarvkoden, screenades vi för närvaron av exoniska skarvningsförstärkare (ese), som förutspåddes genom beräkningsanalys. För detta ändamål utnyttjade vi antisense U7snRNA-varianter utformade för att rikta in och maskera kandidaten ESEs (U7a,b,c) eller delvis den autentiska 5 ‘ SS (U7d). Samuttryck av dessa u7snrna-varianter med wt minigene avslöjade att endast kontrollen U7d påverkade skarvning och delvis inducerad exon 5-hoppning (kompletterande Figur 1). Eftersom dessa data inte gav element för ett urval bland de många exoniska nukleotidvariationerna som antecknades i Ha-databaserna (www.factorviii-db.org / och https://databases.lovd.nl/shared/genes/F8) undersökte vi bara C.655G > en förändring, som är den vanligaste missense-förändringen i F8 exon 5.

sammantaget identifierade dessa data mutationer som orsakade avvikande skarvning och gav kandidater att utforska skarvkorrigering av ExSpeU1s.

en unik ExSpeU1 kan rädda flera mutationer men inte varianter vid +1 och +2 positioner på grund av ett förändrat Skarvningsregister

i försöket att återställa korrekt exondefinition designade vi en kompensatorisk U1snRNA och tre ExSpeU1 med perfekt komplementaritet med vildtypen 5 ‘ SS respektive de intilliggande introniska sekvenserna (figur 2a). Effekten av dessa u1snrna-varianter har initialt utvärderats på c.669a > t-förändring sedan mutationer vid -2-positionen för 5 ‘ SS har tidigare visat sig vara rescuable av den modifierade U1snRNA-baserade metoden (Alanis et al., 2012). Samtransfektionsexperiment ledde oss att välja kompensations U1sRNA (U1d) och en ExSpeU1 (U1sh7) som märkbart räddade skarvning. I synnerhet avslöjade den densitometriska analysen av band att samuttryck av U1d och U1sh7 var förknippad med en ökning av korrekt skarvade transkript (från 52 3% till 71 3% eller 75 4% för U1d respektive U1sh7) (figur 2A).

baserat på dessa resultat och på det faktum att ExSpeU1, genom att binda till en mindre konserverad intronisk region, potentiellt säkerställer högre exonspecificitet (Rogalska et al., 2016; Donadon et al., 2019) valdes U1sh7 för vidare utredning på en förstorad panel av varianter. Samtransfektionsexperiment visade att U1sh7 anmärkningsvärt räddade C.669A > g, c.669A > T och c.670G > t-varianter (> 80% av korrekta transkript) och verkade också ha en korrigeringseffekt (från 0% till 40% i 20%) på dem vid de konserverade positionerna +1 (c.670+1a) och +2 (c.670+2G) (Figur 2B).

det oväntade utseendet på transkript med en storlek som är kompatibel med korrekt skarvning även för mutanter vid positionerna +1 och +2 fick oss att ytterligare analysera skarvningsresultatet genom fluorescerande märkning av amplikoner följt av denaturering av kapillärelektrofores (Figur 3 och kompletterande Figur 3). Detta tillvägagångssätt, i celler som uttrycker +1 och +2-varianterna ensamma, avslöjade närvaron av spårnivåer av avvikande transkript som skiljer sig åt för endast några nukleotider (-1, +1 och +4 bp). I synnerhet identifierades -1 och +1 avvikande transkript endast i c.670 + 1t och c.670 + 2G sammanhang (7,1 2,4% och 1,3 0,7%, respektive), medan +4 transkriptet detekterades för C.670+1t (1,1 0,8%), c.670+2G (1,4 0,8%) och C.669t mutant (1 0,6%).

genom detta tillvägagångssätt utvärderade vi sedan effekten av U1sh7, som omdirigerade spliceosomen på exon-intron-korsningen, vilket indikeras av de generellt minskade transkripten som härrör från användningen av den distala kryptiska 5 ‘ SS. På grund av mutationerna vid de avgörande positionerna tvingade U1sh7 användningen av den intilliggande kryptiska 5 ‘ SS, skapad/förstärkt av mutationer, och ökade anmärkningsvärt andelen +4 former för c.670+1t (från 1,1 0,8 till 72,6 2,2%) och c.670+1A (från 0 till 55,3 2,1%) och +1 former för c.670 + 2G (från 1% till 34% till 1 till 34%) varianter.

när det gäller de andra mutanterna tillät den denaturerande kapillärelektrofores oss att slutföra den korrekta utvärderingen av U1sh7-medierad räddning på den valda panelen av mutationer. Som visas i figur 3B ledde samuttrycket av U1sh7 till en märkbart ökad andel korrekta transkript för C.602-10t > G-varianten vid 3 ‘s och c.669A > T, c.669A > g, c.670G > T, c.670+5G > A och c.670+6T-varianterna vid 5’ SS.

sammantaget dissekerade våra data vidare de avvikande skarvningsmönstren associerade med ha-orsakande mutationer och identifierade en unik ExSpeU1 som kunde rädda flera mutationer, förutom +1/+2 varianter som lider av ett ogynnsamt sammanhang.

diskussion

tillkomsten av nästa generations sekvensering har enormt utökat antalet genvariationer associerade med mänskliga sjukdomar, vilket utgör problemet med att identifiera de orsakande. Detta är särskilt svårt för nukleotidförändringar som, vid exon-intron-gränserna eller inom introner, är kandidat för att påverka skarvning eftersom deras exakta effekt knappast är förutsägbar av beräkningsverktyg. Scenariot kompliceras ytterligare av överlappade skarv-och aminosyrakoder inom exoner, vilket kan leda till missense-förändringar som utövar sina patogena roller genom att ändra skarvprocessen snarare än proteinbiologin (Tajnik et al., 2016; Donadon et al., 2018a).

i detta sammanhang är den experimentella utvärderingen av effekterna av nukleotidförändringar på skarvning obligatorisk för att hjälpa diagnos och rådgivning. Här tog vi upp denna fråga i ett singulärt genkontext, nämligen F8 exon 5, där olika exoniska förändringar och flera kryptiska 5 ‘SS är respektive belägna inom eller i närheten av den autentiska 5’ SS, vilket komplicerar valet av den rätta.

analysen av skarvmönstret för c.602-10a > g nukleotidförändring, med märkbara nivåer (38% av 28%) av korrekt skarvade transkript, överensstämmer med den milda koagulationsfenotypen som rapporterats hos patienten. Omvänt är C.602g > A (p.G201E), c.655g > A (p.A219T) och C.667G > a (p.E223G) missense-varianter inte associerade med signifikanta skarvningsförändringar, vilket indikerar att FVIII-brist huvudsakligen orsakas av de underliggande aminosyrasubstitutionerna som försämrar proteinbiosyntes/funktion. Denna observation förstärks också av data med antisense U7snRNAs som inte stöder närvaron av viktiga reglerande exoniska element i F8 exon 5, som kan ha ändrats av exoniska förändringar. Men i närheten av 5 ‘ SS överlappar skarvkoden med aminosyraregistret, varvid skarvningen är den första som används i genuttrycksflödet. När det gäller mutationer som förekommer inom 5 ‘ SS är det värt att notera att de exoniska C.669a > G (p.E223E), C.669a > T (p.E223D) och C.670G > t (p.G224W) varianterna tydligt förändrar skarvning. Medan c.669A > T är huvudsakligen associerad med exonhoppning och förlust av exondefinition, C.669a > G och särskilt C.670G > t-varianterna leder till partiell intron retention, med användning av en stark intronic 5 ‘ s vid position +177. Märkbart resulterade skarvningsanalys av varianter vid olika positioner av samma triplett (c.667G > a, c.669a > G och c.669a > T) som kodade för glutaminsyra vid position 233 i FVIII i olika skarvningsresultat, allt från exonhoppning till användning av kryptisk skarv 5 ‘ SS eller null. Detta resultat belyser behovet av noggrann utvärdering av effekterna av exoniska förändringar på skarvning, på grund av den begränsade hjälpen av bioinformatisk analys för att förutsäga patogeniciteten hos nukleotidförändringar. Det är värt att notera att nivåer av korrekta transkript för varianterna c.669a > T (p.E223D) (40% i 270 g) och C.6241> t (10% i 10%) tyder på att den associerade FVIII-bristen (måttlig/svår) skulle uppstå från en kombination av skarvning och proteinförsämring. Å andra sidan mutationerna vid de introniska positionerna +1/+2/+5 var inte kompatibla med korrekt skarvning. Annorlunda ledde + 6-varianten till anmärkningsvärda nivåer av korrekt skarvade transkript, i enlighet med de svåra eller milda koagulationsfenotyperna som rapporterats hos HA-patienter.

kunskapen om avvikande skarvningsmönster lägger grunden för utforskningen av korrigeringsmetoder för terapeutiska ändamål, som vi gjorde i flera andra mänskliga sjukdomsmodeller. Intervention på mRNA-nivå har fördelen att upprätthålla den fysiologiska genregleringen och baseras på leverans av små kodande kassetter, vilket möjliggör exploatering av någon viral vektorstrategi. Bland de olika strategierna demonstrerade konstruerade U1sRNAs förmågan att rädda flera mutationstyper, inklusive förändringar vid 5 ‘SS, 3’ S såväl som inom exoner, i cellulära och djurmodeller av mänsklig sjukdom (Glaus et al., 2011; Schmid et al., 2011; Balestra et al., 2014; Balestra et al., 2015; van der Woerd et al., 2015; Dal Mas et al., 2015a; Dal Mas et al., 2015b; Balestra et al., 2016; Rogalska et al., 2016; Tajnik et al., 2016; Scalet et al., 2017; Scalet et al., 2018; Donadon et al., 2018b; Donadon et al., 2019; Scalet et al., 2019). Märkbart visades modifierade U1snrna för att bevara deras korrigeringseffekt även när de riktade introniska regioner nedströms den defekta exonen (ExSpeU1) genom en mekanism som, till skillnad från antisensoligonukleotider som blockerar ett introniskt element, involverar U1snRNP-montering, spliceosome-aktivering och rekrytering av skarvningsfaktorer (Martu-Pizarro et al., 2018; Rogalska et al., 2016). Dessutom säkerställer denna andra generation av modifierade U1snRNAs potentiellt högre exon-och genspecificitet sedan deras basparningsförmåga med introniska och därmed mindre konserverade sekvenser, som stöds av nyligen genomförda studier (Donadon et al., 2019; Rogalska et al., 2016). Trots detta måste off-target-effekten av varje ExSpeU1 utvärderas noggrant när man närmar sig kliniker.

i F8 exon 5-sammanhanget identifierade vi en ExSpeU1 som kunde återställa korrekt exondefinition i närvaro av flera mutationer, belägna vid både 3 ‘ss eller 5’ SS. Intressant nog observerade vi att varianter vid + 1 och + 2-positionen på 5 ‘ s, som inte tros vara rescuable av modifierad U1snRNA på grund av deras höga grad av bevarande, resulterade i transkript med storlek jämförbar med den för korrekt skarvade. Nyligen har t > C-övergången vid position +2 av 5 ‘ SS visats vara rescuable genom modifierad U1snRNA (Scalet et al., 2019), ett resultat som är kompatibelt med observationen att en liten bråkdel av introner avlägsnade av U2-typ spliceosom har cytidin vid position +2 (Burset et al., 2000). Det finns också exempel på mutationer vid +1-position som är kompatibla med korrekt bearbetning (Hartmann et al., 2010), vilket potentiellt öppnar möjligheten att rädda dem. Här, för att dissekera den svårfångade naturen av transkript, utnyttjade vi denaturerande kapillärelektrofores, en strategi som kan skilja amplikoner som skiljer sig från endast en nukleotid. Analysen av skarvningsmönstren avslöjade användningen av kryptisk 5 ‘ s skapad av mutationer (c.670+1g > T och c.670+2t > G) som leder till transkript respektive kortare eller längre av en enda nukleotid. Tyvärr, på grund av det förändrade registret för 5 ‘SS, främjade ExSpeU1 ytterligare användningen av 5’ s annat än den autentiska, vilket försvann korrigeringseffekten.

Sammanfattningsvis visade vi för första gången förmågan hos en unik ExSpeU1 att rädda flera HA-orsakande F8-mutationer genom molekylär karakterisering av olika F8-varianter som uppträder vid 3 ‘s eller 5’ s, eller inom exon. Dessutom belyser våra resultat behovet av att undersöka effekten på skarvning av nukleotidförändringar, särskilt av de som förekommer i exoniska sekvenser, och föreslår en noggrann inspektion av sekvenssammanhang och utvärdering av transkript för att undvika övertolkningar, med konsekvenser för diagnos och rådgivning.

datatillgänglighet uttalande

alla dataset som genereras för denna studie ingår i manuskriptet/kompletterande filer.

Etikuttalande

Etikgodkännande för denna studie krävdes inte enligt den lokala lagstiftningen. Trots detta användes DNA-provet från kontrollpatienten efter att ha erhållit informerat samtycke.

Författarbidrag

alla författare bidrog väsentligt till manuskriptet. Manuskriptet utformades och utarbetades av DB, MP och FB. IM utförde kapillärelektroforesanalysen och AB, MF och DB utförde experimenten. Sammantaget granskades manuskript klarhet av alla författare, och alla godkände dess innehåll.

finansiering

författare vill erkänna stödet från programmet Early Career Bayer Haemophilia Awards (BHAP 2017, DB).

intressekonflikt

MP är uppfinnare av ett patent (PCT/IB2011/054573) på modifierade U1snrna.

de återstående författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Kompletterande Material